BL21（DE3）电转感受态细胞

BL21(DE3)电转感受态细胞

产品规格CAT#: BFNC86092-01(5×50ul)/BFNC86092-02(20×50ul)

BL21(DE3) Electroporation-Competent Cell                  50μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                                        10μl

保存条件(保质期)：                                                 -80℃（6个月）

基因型

F^- ompT hsdS_B(r_B^- m_B^- ) gal dcm(DE3)

产品说明

BL21(DE3)为Lon蛋白酶和OmpT外膜蛋白酶缺陷菌株。λ噬菌体DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶，该区整合于BL21的染色体上，所以称为BL21(DE3)。BL21(DE3)菌株可同时表达T7 RNA聚合酶和大肠杆菌RNA聚合酶，用于pET系列，pGEX，pMAL等质粒的蛋白表达。

青旗生物生产的BL21(DE3)电转感受态细胞经特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率达1×10¹⁰ cfu/μg DNA，可用于各种多肽，蛋白表达文库的构建。

操作方法

1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的BL21(DE3)电击感受态细胞插入冰中5分钟，待其融化，加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手bo打EP管底轻轻混匀，避免产生气泡，立即插入冰中。

      A. 测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19；

      B. 对于连接产物，大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与BL21(DE3)电击感受态混合后电击转化，无需进行DNA纯化，但DNA浓度不能过高，DNA浓度不超过100 ng/μl，体积不超过5 μl/50 μl感受态。

      C. 对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬，然后与BL21(DE3)电击感受态混合进行电击转化。

 3. 用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中，避免产生气泡，盖上杯盖。

 4. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 Ω，V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数，也可按所用电转仪推荐的参   数操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中。

 5. 2分钟后从冰中取出电击杯，放室温，加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基（室温），用1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后，转移到50 ml离心管（BD Falcon 50 ml锥形离心管等），向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃，225 rpm复苏60分钟。

 6. 5000 rpm离心一分钟收菌，重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的S.O.C平板上（因菌量较大，若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个）。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养13-17小时。

BL21(DE3)电转感受态细胞

S.O.C 培养基配方

2% Tryptone

0.5% Yeast Extract

10 mM NaCl

2.5 mM KCl

10 mM MgCl₂

10 mM MgSO₄

20 mM glucose

PH-7.0

S.O.C. Medium is suitable for use in the final step of cell transformation to obtain

maximal transformation efficiency of E. coli (Hanahan, 1983).

注意事项

1. 加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。

2. 电转感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡，气泡会增加弧光放电风险。

3. 当DNA不纯或存在盐，乙醇，蛋白及缓冲液等污染时，转化效率急剧下降。

4. 电击杯里的离子可增加溶液的电导，增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。

5. 若转化大质粒或想获得较高转化效率，推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

6. 对于连接产物转化，部分公司的连接体系或重组体系(例如：Thermo，NEB公司的T4 连接酶系统，NEB，天根的50度反应重组系统)可以直接与BL21(DE3)电击感受态混合后电击转化，无需纯化，但DNA浓度不能过高，尽量不超过100 ng/μl。过高浓度连接产物或过大体积连接产物会降低转化效率，增加弧光放电的风险。

7. 混入质粒时应轻柔操作，吸取感受态细胞时避免用力过猛，以免剪切力过大损伤细胞膜，降低转化效率。转化高浓度的质粒或连接产物可相应减少终用于涂板的菌量。

8. 电转感受态细胞尽量保存在-80℃以下，高于-80℃超期储存会导致转化效率会下降。